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                      原代細胞培養
                      牛視網膜/小鼠腦微血管內皮細胞

                      時間:2020-07-17 16:04:00 瀏覽:6167次


                      威斯騰生物經過10多年的發展,獲得了上百種細胞株和四十余種原代細胞培養經驗,并建立了龐大的細胞庫及原代培養資料庫。細胞平臺有資深實驗員、規范的SOP操作文件,萬級凈化細胞房,這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時,威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養經驗,結合平臺已有的技術優勢,建立了完善的體外藥篩實驗,并引進RTCA(Real-time cellular Analysis,實時無標記細胞記錄儀),在藥篩過程中,全程實時記錄細胞真實狀況,為藥篩提供最真實精準的實驗數據。

                      無菌操作注意事項

                      細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔,先用紫外燈和臭氧殺菌1h,然后通風30min,操作前需要換細胞間專用拖鞋,雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒,穿上實驗服,戴上一次性口罩和帽子,操作時不能大聲說話,整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。


                      牛視網膜血管內皮細胞

                      (1)取成牛眼球,75%酒精消毒,取出周圍多余組織,用PBS洗3次,用PBS流水沖洗眼球3次。

                      (2)沿角膜緣剪開眼球,棄掉角膜、晶體、玻璃體等部分,將眼球后半部翻轉取出視網膜,將其剪碎平皿內加入適量0.25%的胰酶,在37℃培養箱中,采用分次消化,每次消化20min約8次。

                      (3)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM培養基,輕輕混勻,中和胰酶的消化,防止消化過度。用200目細胞過濾篩子過濾含細胞的混合液,最后將過濾后的細胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀,用PBS再次重復離心3次。用細胞培養基將細胞沉淀重懸,接種于細胞培養瓶中培養,并每日觀察細胞的生長,接種后約4d后有少量細胞貼壁。


                      小鼠腦微血管內皮細胞分離

                      1.C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養皿中,打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

                      2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養皿中,用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜,保留大腦皮質。
                      3. 用D-Hanks'液漂洗3次后,加入1 ml DMEM培養液,用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小,加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I,1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。
                      4. 離心(1 000 rpm,5 min,室溫),去上清液,加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g,20 min,4 ℃),去除中上層神經組織及大血管,保留底部沉淀。
                      5. 加入3 ml 2.5%胰酶消化液消化20min,加入等量含血清培養基終止消化,離心(1 000 rpm,8 min,室溫),去上清液,加入2 ml DMEM培養液懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g,60 min,4 ℃)。
                      6. 離心(1 000 g,10 min,4 ℃),靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm,5 min,室溫),去上清液。
                      7. 加入DMEM完全培養液(含20% FBS)懸浮后接種于涂布基質的35 mm一次性塑料培養皿(1.5 ml/培養皿,可接種1個培養皿/大腦),置于37 ℃、5%CO2培養箱內靜置培養,12~24 h后換液,并加入1 ng/ml bFGF,隨后隔天換液。

                      細胞形態

                      腦微血管內皮細胞原代培養過程中,約24h即可貼壁生長,細胞呈長梭形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯,出現以梭形為主的多種形態,5- 7d 70%-80%可融合達到傳代標準。


                      威斯騰實驗服務流程



                      威斯騰生物服務項目

                      細胞生物學檢測 高通量測序 代謝組學
                      細胞原代培養 mRNA測序 氣相色譜GC/MS
                      MTT檢測 LncRNA測序 液相色譜LC/MS
                      細胞凋亡檢測 全基因組測序 核磁共震NMR
                      細胞周期檢測 RNA-Seq測序
                      細胞克隆形成實驗 外顯子測序 影像學相關實驗
                      Transwell細胞遷移/侵襲 16s擴增子測序 Micro-CT
                      流式分選 Small RNA測序 小動物活體成像
                      CCK8/XTT檢測 宏基因組測序 核磁共振
                      臺盼藍檢測細胞活性 單細胞測序 PET-CT
                      藥物篩選細胞學實驗 circleRNA測序
                      細胞粘附性檢測 甲基化測序 基因編輯動物
                      細胞劃痕實驗 條件性敲除小鼠/大鼠
                      細胞生物學整體實驗 全基因敲除小鼠/大鼠
                      細胞成管實驗
                      病理檢測 CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入 基因芯片
                      掃描電鏡 基因定點突變細胞系 LncRNA芯片
                      透射電鏡 單基因敲除細胞系 miRNA芯片
                      HE染色 多基因敲除細胞系 mRNA芯片
                      免疫組化 目的基因敲入細胞系 甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
                      Tunel(原位末端凋亡法)檢測 報告基因敲入細胞系 SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
                      激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除細胞系
                      免疫熒光
                      Masson染色 CRISPR/Cas9動物敲除/敲入
                      原位雜交 基因敲除大鼠/小鼠
                      熒光原位雜交 基因敲入大鼠/小鼠
                      特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)
                      行為學檢測 藥物篩選服務項目 藥效學評價
                      曠場實驗 高通量自動藥物篩選平臺 抗腫瘤藥物藥效學評價
                      重復性刻板行為檢測 細胞高內涵藥物篩選平臺 心血管系統藥物藥效學評價
                      動物跑臺檢測 蛋白質組學靶標研發平臺 泌尿系統藥物藥效學評價
                      強迫游泳 分子藥理研究平臺 內分泌系統藥物藥效學評價
                      生物膜片鉗藥物篩選平臺 抗炎免疫藥物藥效學評價
                      常規藥物體外篩選

                      【本平臺合作項目】
                      分子生物學、細胞生物學、基因敲出/入、模式動物、SPF動物保種、病理學檢測、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產權服務!
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